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    外泌體蛋白質組研究服務

    外泌體研究背景:

           

            胞外囊泡是從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的具有雙層膜結構的囊泡狀小體,主要由微囊泡、凋亡小體、外泌體組成。而外泌體是其中一類小囊泡,直徑為30~150nm,密度1.10~1.18 g/ml,可攜帶核酸、蛋白質質和脂質等,存在于血液、唾液、尿液等多種體液中。

             越來越多的研究證實,外泌體可以通過細胞間轉移核酸、蛋白質、脂質等特定物質,發揮特殊的功能。如在抗原提呈細胞中呈遞抗原程中、腫瘤細胞發生發展、神經細胞信號轉導過程中都發揮著重要作用。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析。

     

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    外泌體主要內容物——蛋白質:


             外泌體常用的數據庫ExoCarta (http://www.exocarta.org),記錄了超過286個外泌體研究的數據,其中就包含有41860種蛋白質,是所有記錄的外泌體內容物中排名No. 1的分子。由此可見,外泌體內中的蛋白質成分在外泌體相關的生物學研究中占據著重要地位。由于外泌體中蛋白質分子具有多樣性,無論從標志物角度還是疾病機制角度進行研究,外泌體蛋白質無疑會成為未來的明星分子。

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    外泌體研究經典案例:

    案例1——血清GPC1蛋白陽性外泌體可作為胰腺癌診斷標志物



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                    參考文獻:Nature, 2015, 523(7559): 177.


    早期胰腺癌難以診斷,術后生存率低,外泌體+蛋白是否能夠打破胰腺癌診療的魔咒?

            首先,研究人員通過質譜技術篩選多種癌細胞來源的和非癌細胞培養上清中外泌體攜帶的蛋白質差異,發現GPC1在胰腺癌細胞分泌的外泌體中特異富集。然后,利用ELISA技術對比了胰腺癌患者手術前后與各種對照(胰腺癌前病變、良性胰腺疾病、乳腺癌)患者血清中的 GPC1+ 外泌體。

            結論:確認GPC1+ 外泌體可作為胰腺癌預后診斷的有效標志物,診斷效率遠高于現有標志物CA19-9。

    案例2——血漿外泌體S100-A9蛋白激活NF-κB促進淋巴瘤復發




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                     參考文獻: Blood, 2017, 130(6): 777-788.

     


    血漿中的外泌體蛋白既可以當作標志物,也可以進行機理研究?

           首先,研究人員將慢性淋巴瘤(CLL)患者分為2個亞組:疾病進展期和疾病慢性期。然后利用質譜技術分析了患者血漿外泌體蛋白組,發現S100-A9蛋白在進展期CLL患者中明顯高表達,可以作為CLL進展期診斷的輔助標志物。

            進一步,研究人員通過生信分析發現進展期CLL患者外泌體中的高表達蛋白質主要與炎癥和氧化應激有關,而NF-κB通路正是承接此效應的關鍵通路。通過從進展期CLL患者中分離富含S100-A9蛋白的外泌體加入CLL患者的PBMC細胞中,證實了S100-A9+外泌體能夠明顯促進進展期CLL患者PBMC細胞中IκBα蛋白的磷酸化上調,進一步激活NF-κB通路。

           該研究證通過血漿外泌體蛋白組分析不僅找到輔助診斷進展期CLL的標志物,并證實了S100-A9+外泌體可通過形成正向反饋調控,不斷激活進展期CLL患者自身PBMC細胞中的NF-κB通路,促進CLL進展的特殊機理。

    血清/血漿樣本蛋白質組研究的難題

     

             幾乎所有類型的細胞都可以分泌外泌體,同時外泌體也廣泛存在于體液中,包括血液、眼淚、尿液、唾液、乳汁、腹水等。目前文獻報道較多的是基于血漿/血清進行外泌體研究。由于血小板在凝血過程中會分泌大量的外泌體到血清中,作為背景因素干擾外泌體的研究結果。因此,在非血小板相關的研究中,一般建議可以選擇血漿樣本進行實驗。


     

     

     

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                       參考文獻:Circ Res.2017.121(8): 920-922.

     


            然而,血漿/血清中含有大量的脂蛋白質,如高密度脂蛋白質HDL,低密度脂蛋白質LDL,極低密度脂蛋白VLDL,乳糜微粒CM等。外泌體與這些脂蛋白質在物化性質上具有較大的相似性。常規的外泌體分離方法,如超速離心和沉淀法等都無法有效去除血漿/血清中的脂蛋白,嚴重干擾了下游質譜實驗數據的檢出率和可靠性。成為限制血清/血漿外泌體蛋白質組研究的主要難題。

    外泌體蛋白組服務方案

     

            華盈生物開發了一套完整的外泌體蛋白質組學研究技術服務體系,包含外泌體制備、外泌體鑒定、蛋白組定性定量分析、數據分析等各個環節。

            在外泌體制備階段,根據客戶需求,華盈生物既可以提供經典的超速離心分離服務,又可以提供脂蛋白去除效果更優的qEV尺寸排阻法分離服務。在外泌體鑒定階段,華盈生物不僅可以提供經典的NTA分析,還可以提供準確度更高的TRPS分析。在外泌體蛋白組分析階段,華盈生物可根據總體實驗設計,提供基于標記和非標記的蛋白質組學方法,并提供完備的驗證服務。


     

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    樣本要求


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    盈生物技術優勢

    優勢1:高純度外泌體制備優勢



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             與超離法相比,尺寸排阻法(qEV尺寸排阻分離柱)收集的血清外泌體數量與總蛋白質量比值更高,說明尺寸排阻法富集的血清外泌體純度更高,更有助于外泌體蛋白質組的檢測與分析。

            外泌體研究頂級雜志J Extracell Vesicles中的文獻報道:超離法只能部分去除LDL和VLDL,無法有效去除HDL,其收集的外泌體中存在大量污染蛋白質。而尺寸排阻法可有效去除HDL和大部分LDL,有效提高外泌體純度。

       

     

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    優勢2:微量樣本需求

     

        華盈生物通過超離心法和尺寸排阻法(qEV分離柱)分別收集1.5 mL和500 μL血清中的外泌體,應用非標記定量Label free質譜技術進行外泌體蛋白質組學分析。結果顯示超速離心共鑒定到533種蛋白質。而尺寸排阻法共鑒定到607種蛋白質,兩種方法鑒定的蛋白質均包含CD9、CD63、CD81幾種標志物,并且超過60%ExoCarta收錄。

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    優勢3:質譜+芯片雙平臺


            華盈生物擁有LC-MS/MS和抗體芯片兩大技術平臺, 針對不同的研究需求,選擇更優的技術。Orbitrap Fusion Lumos是Thermo Fisher推出的頂級的質譜儀,具有超高分辨、高靈敏度、多級質譜能力,在外泌體蛋白組分析中發揮了巨大優勢??贵w芯片,抗原抗體反應原理,不受高豐度蛋白干擾,數據準確度高,可有效檢測微量指標如分泌型細胞因子的篩選。

     

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    抗體芯片:適用于特定種類分泌型蛋白質篩選研究,在大批量樣品實驗中具有優勢。

     

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    質譜技術:適用于尋找廣泛類型外泌體差異蛋白質譜,在膜蛋白質篩選上優勢明顯。

    優勢4:豐富的項目經驗


            華盈生物外泌體蛋白組服務平臺擁有豐富的服務經驗,不僅在各種細胞上清樣本外泌體蛋白組研究中擁有穩定優勢,在多個物種的血漿/血清樣本外泌體研究中均有優秀的數據呈現,并不斷突破檢測上限。在組織、胃液、微生物培養基等特殊樣本的外泌體項目中也不斷摸索形成了穩定的技術路線,承接越來越多的科研服務任務。

    已有項目經驗:

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    代表外泌體蛋白組數據:

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    代表客戶文章:


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    參考文獻:


    免疫調控

    [1]Extracellular vesicles from Trypanosoma brucei mediate virulence factor transfer and cause host anemia. Cell. 2016; 164(1-2): 246-57.

    [2]Exosomes secreted by apoptosis-resistant AML blasts harbor regulatory network proteins potentially involved in antagonism of apoptosis. Mol Cell Proteomics. 2016 Jan 22. pii: mcp.M115.052944.

    腫瘤轉移與血管生成

    [1]Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 2015; 527(7578): 329-35.

    [2]Proteomic analysis of exosomes from nasopharyngeal carcinoma cell identifies intercellular transfer of angiogenic proteins. Int J Cancer. 2015; 137(8): 1830-41.

    生物標志物

    [1]Song Z, Xu Y, Zhang L, et al. Comprehensive Proteomic Profiling of Urinary Exosomes and Identification of Potential Non-invasive Early Biomarkers of Alzheimer’s Disease in 5XFAD Mouse Model[J]. Frontiers in genetics, 2020, 11.
    [2]Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 2015; 523(7559): 177-82.

    [3]Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 2015; 17(6): 816-26.

    干細胞治療

    [1]Comprehensive Proteomic Analysis of Mesenchymal Stem Cell Exosomes Reveals Modulation of Angiogenesis via NFkB Signaling. Stem Cells. 2016 Jan 19. doi: 10.1002/stem.2298.

    [2]Exosomes secreted by human urine-derived stem cells could prevent kidney complications from type Ⅰ diabetes in rats. Stem Cell Res Ther. 2016; 7(1):24.