文獻賞析

華盈視角:外泌體蛋白組如何幫助小樣本量 標志物研究發到高分雜志?

2020/08/10

高分雜志中的標志物研究一般具有大樣本量、隊列動態隨訪監測、多中心驗證及標志物新穎性等幾個特點。然而,并不是所有標志物研究項目都能夠具備這樣龐大的資源。

那么,如何在小樣本量的基礎上,發表高分標志物研究的文章呢?外泌體首先解決了標志物新穎性的問題,但其它方面的要求就需要通過巧妙的實驗設計和標志物下游的機制研究來作為補充了。今天華盈視角將通過兩個精彩的案例,為大家梳理出一條精煉的小樣本量標志物研究高分文章的思路來。




 

 

案例一 外泌體在慢性淋巴白血病進展中的標志物及功能研究

血液中惡性B細胞增多會促進慢性淋巴白血?。?/span>CLL)的進展。這些惡性B細胞的存活依賴于周圍微環境中的信號調控,其中血漿外泌體就是其中一個調控因素,因此前期研究者對CLL中的外泌體microRNA和蛋白質組也進行了相關分析。但是在CLL不同進展階段外泌體蛋白質組的差異,以及外泌體在CLL進展中的功能機制前期并沒有研究清楚。為了解決上述問題,本案例的研究者對不同階段CLL病人血漿外泌體開展了基于蛋白組學的標志物研究。此項研究2017年發表于Blood雜志(17.543)。

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篩選外泌體蛋白標志物


為了篩選比較CLL不同階段的外泌體標志物,本案例總共納入了34個CLL患者,首先根據病情程度分為了慢性期(16個病人)和進展期(18個病人)2個組別;然后為了追蹤鑒別每一個病人的CLL進展,對每一個病人采取2個時間段收集血漿提取外泌體。對于慢性期病人,2個時間段分別是:診斷階段和隨訪4年后的階段,并且依然屬于慢性期;對于進展期病人,2個時間段分別是:進展性診斷階段和進展晚期(圖1)。

 

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1.外泌體標志物研究分組

研究者首先對分離的血漿外泌體進行電鏡,NTAWestern bloting驗證分析(圖2a-c,之后通過LC-MS/MS蛋白質譜技術對外泌體開展蛋白質組學分析。外泌體標志物發現階段,研究者對5個慢性期病人和5個進展性病人分別按照以上2個時間段收集病人的血漿外泌體開展蛋白質譜研究,利用FunRich軟件對質譜結果進行蛋白-蛋白互作分析,發現在進展性晚期病人外泌體中特異性高度富集炎癥,氧化應激,細胞生長和凋亡,腫瘤增殖以及淋巴細胞侵襲相關通路的蛋白(圖2d,箭頭指示)。說明外泌體中的這些通路蛋白高度表達與CLL的進展有關。為了進一步揭示外泌體中與CLL的進展相關的關鍵蛋白,研究者利用PatternLab軟件以及更嚴謹的準則篩選在進展性晚期特異性表達的外泌體蛋白,最后發現了10個這種特異性蛋白,其中JUP和S100-A9的差異最顯著(圖2e), 之后Western bloting也驗證了JUP和S100-A9高表達在5個進展性病人晚期血漿外泌體而不是前期,同樣在5個慢性期病人診斷階段和4年后的血漿外泌體都沒有表達(圖2e)。因為S100-A9參與炎癥反應,是調控腫瘤生長和轉移的關鍵因子,研究者將S100-A9作為待選標志物驗證。

標志物驗證階段中,收集5個健康者的血漿外泌體,以及對11個慢性期病人和13個進展性病人分別按照以上2個時間段收集血漿外泌體,利用Western bloting檢測S100-A9表達。結果和發現階段一致,在健康者和慢性期病人的2個階段外泌體都有很低的S100-A9表達或者不表達,對于進展期病人,晚期病人血漿外泌體中的S100-A9表達量要顯著高于早期病人(圖2f,g)。這些結果說明CLL病人血漿外泌體高度表達S100-A9與疾病進展有關。

 

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圖2. 外泌體蛋白質組篩選差異蛋白
一個外泌體標志物的前期篩選就完成了,如果沒有再多的臨床樣本量進行標志物的驗證研究,發表在這種級別期刊上那就要基于以上蛋白組學的分析來開展CLL中外泌體的功能機制研究了。

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外泌體標志物功能研究-確定供體細胞


外泌體功能機制研究首先要確定外泌體的供體和受體細胞。研究者發現體外培養的進展性病人的B細胞上清外泌體中高表達S100-A9,說明晚期病人血漿中S100-A9表達的外泌體至少部分來源于惡性B細胞(圖3a)。流式細胞結果也驗證了晚期進展性病人血漿中有更多的S100-A9陽性B細胞(圖3b,c)。因為S100-A9可以激活NFκB信號通路,所以研究者檢測了晚期病人中惡性B細胞中NFκB信號是否也被激活。研究者發現了S100-A9的受體EMMPRIN在CLL病人B細胞中的表達要高于健康對照(圖3d),體外實驗也驗證了S100-A9可以與B細胞表達的EMMPRIN結合(圖3e)。最后研究者也發現在晚期進展性CLL病人B細胞中高表達磷酸化的IKBA(圖3f),并且核內p65蛋白的表達顯著增加(圖3g),CLL病人中S100-A9的表達量和磷酸化的IKBA表達量呈現正相關(圖3h)。這些結果說明在晚期CLL病人惡性B細胞中S100-A9/EMMPRIN/NFκB這條信號通路被激活。

 

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圖3.確定S100-A9表達的外泌體來源

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外泌體標志物功能研究-確定受體細胞


那么外泌體作用的受體細胞是什么?研究者推測在疾病進展中,惡性B細胞增多可能是由于非活性的B細胞轉變成了惡性B細胞:惡性B細胞分泌的外泌體攜帶S100-A9,與非活性B細胞表面的受體結合,激活下游的NFκB信號通路從而活化B細胞。為了驗證這個假設,研究者分離非進展性CLL病人B細胞體外培養,然后分別加入早期進展性病人血漿S100-A9陰性的外泌體和晚期進展性病人血漿S100-A9陽性的外泌體孵育。結果發現表達S100-A9的外泌體會顯著增加非進展性病人B細胞中磷酸化IKBA和核內p65的表達量(圖4a-c)。利用S100-A9抗體預先中和外泌體S100-A9會顯著減弱外泌體對NFκB信號通路的激活效應(圖4d)。這些結果說明晚期CLL病人血漿中外泌體高表達S100-A9,并通過S100-A9/EMMPRIN/NFκB信號通路激活B細胞惡化。

 

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圖4. 確定外泌體的受體細胞及作用機制

案例二 外泌體在囊性纖維化疾病進展中的標志物及功能研究


囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)是由CFTR基因突變導致的進行性遺傳病。隨著年齡增加并發癥的風險也會提高。CF會造成持續性的呼吸道感染,最終導致呼吸衰竭。已有研究表明在CF病人中過量的中性粒細胞征募到肺部會誘導炎癥性肺部損傷。但是CFTR活性減少是怎樣造成這些炎癥反應的并不清楚。本案例的研究者認為外泌體在肺部炎癥中可能執行重要作用。所以研究者利用CF肺表皮細胞系(CFTR基因突變)和不同年齡階段CF病人支氣管肺泡灌洗液(BALF)開展了外泌體的研究。相關成果2020年發表于Thorax雜志(8.834)。

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外泌體NTA計數作為標志物


 

 

為了驗證外泌體數量可以作為CF標志物,研究者對外泌體進行NTA計數(圖4),分別對比肺表皮細胞系上清外泌體和和病人BALF外泌體數量差異(圖4)。研究者首先通過超速離心方法分離的細胞上清和BALF中的外泌體進行電鏡,NTA和Western bloting驗證分析(圖5a-c)。研究者比較了2種CF肺表皮細胞系(CFBE41,CuFi-5)和2種正常肺表皮細胞系(HBE41,NuLi-1)上清外泌體顆粒數,結果發現2種CF肺表皮細胞系會分泌更多的外泌體(圖5d-e)。基于以上細胞結果,研究者在臨床樣本上去驗證BALF中的外泌體數量是否可以區分鑒別不同階段的CF。因為CF病人年齡越高,并發癥的風險就越大,研究者將12個CF病人分為4個年齡組:group1, 1-2;group2, 5-6歲;group3, 8-11歲;group4, 大于18歲;每組3個病人(圖4)。首先每組和年齡匹配的正常人相比,除了1-2歲CF病人,其余3組CF病人BALF含有更多的外泌體(圖5f)。另外在CF病人組間比較,結果發現隨著年齡增加,CF病人BALF中的外泌體逐漸增加(圖5g)。這些結果說明BALF中的外泌體數量與CF的進展具有相關性。

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4. 外泌體計數標志物分組

為了證實CF中外泌體數量變化與CF的直接相關性,是不是直接由于CFTR活性改變而導致的,研究者首先利用治療CF的藥物魯瑪卡托(lumacaftor),特扎卡托(tezacaftor )和伊伐卡托(ivacaftor )處理2種CF肺表皮細胞系(CFBE41,CuFi-5)來恢復CFTR的表達(圖6a-b,左),結果表明藥物處理后的CF肺表皮細胞系(CFBE41,CuFi-5)上清中的外泌體數量會顯著減少(圖6a-b,右)。這說明CFTR活性降低直接導致了細胞分泌的外泌體數量增多。然后研究者比對了4個CF病人處理伊伐卡托前后BALF中外泌體數量,結果發現處理后的CF病人BALF中外泌體數量減少(圖6c),但是沒有顯著性。可能因為樣本數量太少,所以要想對CF病人BALF中外泌體數量作為標志物研究,還需要大量樣本的獨立驗證。所以在這些小樣本研究的前期基礎上,要發高分文章還是要研究外泌體的功能機制。

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5. 外泌體NTA計數

 



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6. CFTR活性降低直接導致了細胞分泌的外泌體數量增多

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外泌體蛋白質組研究


 

 

 

雖然研究者想要研究CF中外泌體和炎癥間的關系,但是從哪里入手?研究者果斷采取了蛋白質譜技術對外泌體進行蛋白組學研究,分析CF外泌體中有哪些蛋白質,然后推測驗證外泌體在CF中的作用。研究者利用label free蛋白質譜技術分析了CF肺表皮細胞系CFBE41和正常肺表皮細胞系HBE41上清外泌體中的蛋白質(圖7a),IPA分析發現CFBE41外泌體中的差異蛋白很多富集到免疫相關通路和整合素信號通路上。對CFBE41外泌體中上調最顯著的10個蛋白分析,發現它們與中性粒細胞脫粒,補體和整合素相關(圖7b),Western bloting也驗證了3個顯著的蛋白VCAM, EPCAM, S100-A12在2種CF肺表皮細胞系(CFBE41,CuFi-5)上清外泌體中的都顯著性上調,和質譜結果一致(圖7c),其中最顯著的是S100-A12蛋白(圖7b,c,紅色箭頭)。然后研究者對總共20個不同年齡段CF病人BALF中的外泌體和10個正常人BALF中的外泌體進行蛋白質譜分析(圖7d)。結果發現CF病人BALF中的外泌體蛋白很高的富集在中性粒細胞脫粒,補體等通路上(圖7e)。然后研究者比對了CF疾病進展中各個年齡段BALF中外泌體蛋白的差異,研究者將1-2歲CF(group1)病人組分別和5-6歲組(group2),8-11歲組(group3),大于18歲組(group4)相比,分別有45,116和42個顯著差異蛋白。并且group3和group4中S100-A12都顯著上調(圖7f,紅色箭頭),這個結果和細胞上清外泌體質譜結果一致,說明外泌體高表達S100-A12可能與CF的進展相關。

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圖7. 外泌體蛋白質組學

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外泌體功能研究


 


蛋白組學已經揭示了CF中外泌體富含和中性粒細胞相關的蛋白,所以研究者聚焦在外泌體和中性粒細胞間的關系上。研究者驗證了從健康者和CF病人全血分離的中性粒細胞都可以攝取標記的CFBE41上清外泌體(圖8a)。和HBE41上清外泌體相比, CFBE41上清外泌體可以顯著增加健康者中性粒細胞活性和遷移率(圖8b)。CF病人(13-17歲)的中性粒細胞經CFBE41上清外泌體處理后,遷移率會顯著高于健康者和低年齡段CF病人(2-4歲)(圖8c)。這些結果說明CF肺表皮細胞來源的外泌體可以促進中性粒細胞遷移和提高其活性,隨著疾病進展這種效果會更加明顯。那么外泌體調控中性粒細胞的機制是什么?來自于質譜結果提供了重要線索,因為S100-A12高表達在CF外泌體中,研究者推測外泌體的功能依靠S100-A12介導的信號通路實現的。研究者發現CFBE41上清外泌體處理的中性粒細胞會顯著增加S100-A12的受體RAGE和下游效應蛋白磷酸化p38,磷酸化p44的表達(圖8d),CFBE41細胞中沉默S100-A12后,上清外泌體對中性粒細胞的作用效應會顯著下降(圖8f)。這些結果說明CF中肺表皮細胞分泌的外泌體對中性粒細胞的作用效能依賴于S100-A12/RAGE信號通路。

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圖8. CF外泌體的功能分析

小結

 

 


這兩篇文章都是先用小樣本量開展外泌體標志物的研究,然后,在篩選到外泌體計數差異或者蛋白差異后,并沒有進行傳統標志物的大樣本驗證。而是通過基于外泌體蛋白質組學的方法開展了功能研究。兩個研究都按照相似的方案去揭示外泌體的作用機制:首先確定外泌體的供體細胞和受體細胞,然后根據蛋白組篩選的差異蛋白分析作用機制,最后驗證信號通路是外泌體發揮作用的機制。由此可見外泌體蛋白質功能機制的研究并不是很難,只要找準了關鍵蛋白,之后進行蛋白互作分析信號通路分析驗證機制。華盈視角依據兩個案例的研究思路為大家總結了如下技術路線,供大家參考:

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華盈生物在外泌體領域,經過多年的深耕與發展,逐漸形成了一套完整的科研服務體系,服務涵蓋:提取、鑒定、分析及試劑耗材等領域。經過多年發展,華盈生物的外泌體業務在國內享有較高的聲譽。但我們不止于此,近兩年我們積極與國際知名外泌體研發企業合作,引入不同的儀器、試劑、耗材,為廣大科研工作者的研究更添一臂之力。

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相關文獻

 

 

 

1. Daniel Prieto, Natalia Sotelo, Noé Seija et al., S100-A9 protein in exosomes from chronic lymphocytic leukemia cells promotes NF-κB activity during disease progression.[J].Blood.2017,130(6):777-788. 

2. Zivile Useckaite, Mark P Ward, Anne Trappe et al., Increased extracellular vesicles mediate inflammatory signalling in cystic fibrosis.[J]. Thorax.2020;75(6):449-458.

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