文獻賞析

高分文章策略三 :“玩轉”細胞因子—疾病標志物

2020/11/26

細胞因子包括白介素,干擾素,腫瘤壞死因子和趨化因子等,可以通過多種生化途徑和相互作用在體內發揮著促炎和抗炎的關鍵作用。與其他類型的感染和炎性疾病測試方法相比,細胞因子的檢測具有無創性和低成本的優勢,已經作為診斷多種疾病的炎癥標志物。今天華盈視角就為大家分享幾篇細胞因子標志物研究的案例,領略細胞因子的獨特魅力,一起學習細胞因子標志物的研究怎樣設計和分析,最終揭示出最有價值的臨床診斷指標。



 

  

案例一  血漿細胞因子預測黑色素瘤患者免疫治療后的免疫相關不良事件

本研究在2019年發表于Clin Cancer Res雜志(IF:10.107)1。研究者利用抗體芯片技術對血漿65個細胞因子進行了檢測。在發現階段納入了98個黑色素瘤病人,分為了兩個組別:40個 anti-PD-1治療患者,58個anti-PD-1聯合anti-CTLA-4治療患者(圖1)。驗證階段納入了49個anti-PD-1聯合anti-CTLA-4治療患者。研究者首先在發現階段開展了縱向的比較研究,研究者收集了患者基線期(PRE),治療早期(EDT)和中期(MID)的血漿,結果發現在這3個時期之間細胞因子并沒有顯著性的變化,說明了在免疫治療進程中血漿細胞因子相對穩定。研究者然后在發現階段對51個anti-PD-1聯合anti-CTLA-4治療患者進行了橫向對比,其中有24個患者治療后出現了嚴重的免疫相關不良事件(irAE)。細胞因子檢測發現了在嚴重irAE患者基線期有17個上調的細胞因子,治療早期有16個上調的細胞因子(FDR-adjusted P < 0.05; log2 FC > 0.7),其中11個在基線期和治療早期都上調(圖1)。最后研究者將這11個上調的細胞因子整合成了一個診斷指標值CYTOX score,ROC分析展示了CYTOX score在發現階段和驗證階段都具有較高的診斷效能(圖1)。

 

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圖1. 細胞因子預測黑色素瘤患者免疫治療后的免疫相關不良事件。

ROC結果:cohort2, PRE: AUC=0.776; EDT: AUC=0.765; cohort3, PRE: AUC=0.675; EDT: AUC=0.

  

案例二  血漿和腦脊液中的細胞因子作為多發性硬化癥的診斷標志物

本研究在2020年發表于Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A雜志(IF:9.412)2。本研究通過抗體芯片檢測了腦脊液和血漿中的92個細胞因子。此研究在發現階段納入了136個多發性硬化癥患者(MS),49個健康者(HC),35個其他神經疾病患者(OND)。驗證階段納入了95個MS,47個HC,27個OND,86個癥狀相似的對照(SC)(圖2A)。首先在發現階段研究者對比了MS樣本和其他樣本,發現了11個顯著性差異的腦脊液細胞因子(P < 5 × 10?5),其中有10個可以在驗證階段被成功驗證出來(P < 0.05)(圖2B)。在血漿樣本中,研究者選取了發現階段5個最顯著差異的細胞因子在驗證人群中驗證,其中有2個細胞因子被成功驗證(OSM,Pdis= 0.005, Prep= 2 × 10?4;HGF, Pdis= 0.01, Prep = 0.009)(圖2B)。這些差異的細胞因子在發現階段和驗證階段的相關性也都非常相似(圖2B)。ROC分析展示了在發現人群和驗證人群中腦脊液和血漿中的差異細胞因子單獨,或者聯合都可以高效的區分MS和其他疾病和健康者(圖2C)。最后研究者也對其中藥物治療前后的MS患者進行了細胞因子檢測,藥物處理也會改變患者腦脊液和血液中的多種細胞因子(圖2D,E),說明了細胞因子可以作為指示藥效的標志物。

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圖2. 血漿和腦脊液中的細胞因子作為多發性硬化癥的診斷標志物。

  

案例三  血清細胞因子預測白血病患者免疫治療后的細胞因子釋放綜合癥

此項研究在2016年發表于Cancer Discov雜志(IF:29.497)3。本研究通過Luminex檢測了血清中44個細胞因子。研究者納入了51個CTL019治療的急性淋巴白血病患者,按照年齡分為了兒童組(n=39)和成年組(n=12)兩個人群。研究者收集了基線期和治療進程中不同時間點的血清進行細胞因子檢測(圖3A)。51個患者治療后有48個患者出現了細胞因子釋放綜合癥(CRS)(圖3B)。研究者將CRS患者分為了嚴重性(n=14)和輕度性(n=34)。研究者對比了嚴重CRS和輕度CRS的所有樣本檢測結果,發現了24個細胞因子在嚴重CRS血清中顯著上調。之后研究者通過機器學習建立了16個預測模型,ROC分析展示了在所有患者和不同年齡患者中不同組合形式的細胞因子都可以高效的區分嚴重CRS和輕度CRS(圖3C,D)。

 

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圖3. 血清細胞因子預測白血病患者免疫治療后的細胞因子釋放綜合癥。

Timepoint: 血清收集的時間點;* 30-plex Luminex panel; ** 14-plex Luminex panel。數字代表患者數量,表:兒童組;中間和右:成年組。

  

案例四  肺泡灌洗液細胞因子+脂質組+基因表達聯合診斷不同亞型的哮喘

本研究在2020年發表于J Allergy Clin Immunol雜志(IF:10.228)4。此項研究分析了肺泡灌洗液(BALF)中的3個指標:(1)通過Taqman分析了肺泡灌洗液細胞中32個免疫相關的基因和16個類二十烷酸途徑的基因表達;(2)通過GC-MS分析了15個類二十烷酸分子;(3)通過Luminex分析了32個細胞因子。本研究納入的病人包括22個患有非甾體類抗炎藥加重呼吸系統疾病的哮喘病人(N-ERD),21個非甾體抗炎藥耐受性哮喘患者(NTA)和11個健康對照者。研究首先根據哮喘患者BALF中免疫細胞的比例分為了4種亞型:嗜酸性細胞增多型(E),顆粒細胞缺乏型(P),中性粒細胞增多型(N),嗜酸性細胞和中性粒細胞增多型(E/N)。相比NTA組,N-ERD組中E型的比例更多(54.5% vs 9.5%)(圖4A,B),嗜酸性細胞增多會上調TH2 細胞的基因表達,因此E型哮喘被稱之為T2類型的哮喘。研究者然后對比了N-NED組中E型和non-E型肺泡灌洗液中的3個指標,發現E型N-NED中差異的基因,細胞因子和類二十烷酸都與嗜酸性細胞增多具有顯著相關性,同時這3類指標間的也具有很高的相關性(圖4C)。相比全身性的檢測指標,肺泡灌洗液中的這些差異指標對于區分E型和non-E型N-NED更加準確(圖4D)。最后研究者整合分析了所有哮喘患者的細胞因子和類二十烷酸檢測指標,聚類分析形成了2個簇,分別是T2類型和non-T2類型(圖4E)。與免疫細胞分型一致,根據這些差異指標,E型哮喘也都聚成一簇。同樣這些差異指標可以高效的區分T2類型和non-T2類型哮喘(圖4F)。

 

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圖4. 肺泡灌洗液細胞因子聯合脂質組和基因表達診斷不同亞型的哮喘

  

案例五  血清細胞因子+蛋白質組聯合診斷不同亞型的全身型幼年特發性關節炎

此研究在2019年發表于Ann Rheum Dis雜志(IF:16.102)5。本研究開展了血清label free蛋白質組和150個細胞因子的Luminex,及MRM-MS的血清標志物的篩選和驗證研究。研究者總共納入了136個病人,在發現階段納入了10個發熱的全身型幼年特發性關節炎患者(SJIAsyst),10個多關節疾病的全身型幼年特發性關節炎患者(SJIApoly),10個患有關節疾病的感染病人(infection),在驗證階段納入了45個SJIAsyst,29個SJIApoly,32個infection患者。研究者首先在發現階段對比了SJIAsyst分別和SJIApoly,infection血清蛋白組,鑒別了總共72個差異蛋白,其中有48個蛋白可以在驗證階段通過MRM-MS分析,ROC分析了展示了30個最佳的多肽對應的蛋白可以非常高效的區分診斷SJIAsystSJIApoly(AUC=0.909)(圖5A),以及SJIAsyst和infection(AUC=0.661)(圖5A)。研究者在發現階段對150個血清細胞因子進行篩選,去除無差異和檢測不到的因子,最終研究者篩選出了17個細胞因子在驗證階段利用Luminex檢測。最后研究者整合MRM和Luminex檢測結果,ROC分析展示了血清蛋白組和細胞因子聯合具有更高的診斷能力(SJIAsyst vs SJIApoly, AUC=0.918; SJIAsyst vs infection, AUC=0.803)(圖5B)。另外分開比較MRM和Luminex檢測的診斷效能,結果展示了Luminex檢測的細胞因子比MRM鑒定的蛋白更能有效的區分診斷SJIAsyst和infection患者(AUC: 0.840 vs 0.661)(圖5C),這不僅說明了對于診斷疾病的不同類型,蛋白質組和細胞因子具有各自的優勢,還提示了同時檢測多種類型的指標或者多組學聯合分析的必要性。

 

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圖5. 血清細胞因子+蛋白質組聯合診斷不同亞型的全身型幼年特發性關節炎

從這幾個精彩的案例可以看出細胞因子的檢測毫無疑問具有很大的臨床價值。那么怎樣才能把細胞因子的價值體現出來呢,把這樣的研究發到高分期刊上呢?上述的研究案例或許給出了一定的啟示。首先這些案例的臨床樣本并不是很多,但是在樣本分組設計上都非常的巧妙,病人分層的細化程度很高,同種疾病的亞型多樣化;其次對病人治療前后的縱向跟蹤;然后就是細胞因子與其他檢測指標聯合分析,包括實驗室指標,蛋白組學,脂質組,代謝組和轉錄組。如此的研究思路和策略定能助力大家的研究更易被高分期刊接收。

 

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圖6. 細胞因子標志物研究策略

除了以上研究方案上的創新,細胞因子的研究還存在檢測方法靈敏度的問題。相當一部分因子在血漿/血清中含量很低,普通的ELISA很難檢測到,例如神經相關的因子,還有像IL-2、IL-6、IL-17A、TNF-α等豐度極低的炎癥因子等。例如第5個案例中研究者篩選150個細胞因子,發現部分因子無法檢測到而剔除,那么引起了一個問題:這些無法檢測因子與疾病也具有相關性,怎樣才能檢測到呢?近年來盛起的Simoa(Single-molecule Array)技術可謂一騎絕塵,靈敏度比ELISA提高出1000倍以上,它的出現將蛋白質檢測技術直接帶入到單分子、數字化檢測時代,成為fg級超低豐度蛋白質檢測領域的優勢技術。David Yeung等6研究人員對比了目前世界上幾乎所有超敏蛋白質檢測技術對于IL-2、IL-6、IL-17A、TNF-α等低豐度炎癥因子的檢測情況,發現Simoa技術無論在靈敏度還是在數據重現性上,相比其他技術均具有顯著優勢。利用Simoa細胞因子 6‐plex Panel 可以檢測到低至2 fg/ml的IL‐12p70(圖7)。Simoa還可以在血清/血漿中檢測NfL、Tau、pTau、Aβ40、Aβ42等超低豐度神經因子,例如在阿爾茲海默癥初期(提前16年),Simoa可以在接近正常人的患者血清中檢測到蛋白標志物NfL7。由此可見Simoa的檢測能力真的超乎我們的想象,可以滿足其它技術無法完成的檢測需求。

 

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圖7. Simoa細胞因子 6‐plex Panel檢測因子的下限范圍

LOD:Limit of Detection,詳見https://www.quanterix.com/technology

華盈生物擁有“高通量抗體芯片”(解決標志物篩選階段需求)、“Luminex液相懸浮芯片” (解決標志物驗證階段需求)、“單分子高敏Simoa技術” (解決超低豐度細胞因子檢出需求)三個細胞因子檢測平臺,三平臺各具優勢,經過華盈生物有機組合,可滿足細胞因子標志物全方位需。在蛋白標志物研究篩選、驗證、轉化的各環節,華盈生物均能夠為科研人員提供適合的技術選擇,幫助科研人員獲得更高質量的科研數據。


 

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圖8. 華盈生物細胞因子檢測“一站式”服務平臺

相關文獻

 

1. Lim SY, Lee JH, Gide TN et al., Circulating Cytokines Predict Immune-Related Toxicity in Melanoma Patients Receiving Anti-PD-1-Based Immunotherapy. [J]. Clin Cancer Res. 2019;25(5):1557-1563. 

2. Huang J, Khademi M, Fugger L et al., Inflammation-related plasma and CSF biomarkers for multiple sclerosis. [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(23):12952-12960. 

3. Teachey DT, Lacey SF, Shaw PA et al., Identification of Predictive Biomarkers for Cytokine Release Syndrome after Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. [J]. Cancer Discov. 2016;6(6):664-679. 

4. Jakiela B, Soja J, Sladek K et al., Heterogeneity of lower airway inflammation in patients with NSAID-exacerbated respiratory disease. [J]. J Allergy Clin Immunol. 2020;S0091-6749(20)31135-0. 

5. Gohar F, McArdle A, Jones M et al., Molecular signature characterisation of different inflammatory phenotypes of systemic juvenile idiopathic arthritis. [J]. Ann Rheum Dis. 2019;78(8):1107-1113. 

6. Yeung D, Ciotti S, Purushothama S et al., Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg/mL levels of cytokines in human serum. [J]. J Immunol Methods. 2016;437:53-63. 

7. Preische O, Schultz SA, Apel A et al., Serum neurofilament dynamics predicts neurodegeneration and clinical progression in presymptomatic Alzheimer's disease. [J]. Nat Med. 2019;25(2):277-283.

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