文獻賞析

《JEV》外泌體粒徑分析儀器選擇

2021/03/24

外泌體是近幾年非常熱門的研究領域,不少專注于外泌體研究的期刊也應運而生。在眾多新創辦的期刊中,有一本期刊可謂一枝獨秀,那就是Journal of Extracellular Vesicles (JEV)。JEV國際細胞外囊泡協會(ISEV)的會刊,該期刊由Clotilde Thery教授領銜的一眾外泌體領域大牛作為編委,該期刊收錄的雜志在細胞外囊泡領域都具有指導性的意義。

在今年1月首次發表在該期刊上的一篇文章可謂是掀起了外囊泡檢測技術之間“BATTLE”的軒然大波,在本文中召集了全世界主流的納米顆粒檢測技術(如納米流式,NTA,TRPS等)的應用科學家以及目前商業化比較成熟的幾款儀器設備集中在一起進行功能比較,旨在給予納米醫學以及細胞外囊泡研究領域的科研人員提供不同樣本所搭配最合適的解決方案。



如文中所述,分析生物樣本(如體液、血液、細胞培養上清等)的納米顆粒的實驗中,如何將復雜的多分散復合生物樣本中的所有組分進行細分,去除雜質和無關因素干擾等問題都是影響后續實驗的至關因素。特別是細胞外囊泡(EVs)的濃度和粒徑分布等理化性質對于評估EVs的獲得和純化效果至關重要。支撐EVs表型的關鍵三大支柱分別是尺寸,濃度測量和形態學樣貌。其中確定形態學鑒定需要通過觀察電鏡,而測量EVs的濃度和粒徑分布是實驗可重復性挑戰的第一步。在這項研究中,通過逐步提高復雜性的方式,全面研究了6種不同的技術在測量50-300 nm尺寸范圍內不同類型顆粒的性質。


六種應用的技術分別是:多角度動態光散射(MADLS),不對稱流場流動分餾與多角度光散射(AF4-MALS),離心液體沉降(CLS),納米粒子跟蹤分析(NTA),可調電阻脈沖傳感(TRPS)和高靈敏度納米流式細胞儀(nFCM)。讓我們一起看看他們在各種分析環境中的優勢吧:

一 化合物樣品檢測

1.1單一樣本檢測比較用六種不同的技術同時測量同一個樣本,選取的化合物樣本由一些已知平均粒徑和電鏡形態的聚苯乙烯材料組成。當上樣的檢測平均粒徑分別為100 nm,150 nm,200 nm 和240 nm的顆粒時,各個技術所測得的結果如下分布:


NTA,TRPS,nFCM,AF4-MALS和MADLS測量的單峰分布的平均直徑與理論結果比較吻合(誤差在6%之內)。只有CLS始終得到比理論值較小的結果(誤差高達11%),其他研究人員也在先前的比較實驗中也發現了類似的差異(Anderson等,2013)。

濃度:與標準顆粒濃度(1010顆粒/mL)相比,NTA的統計出的總濃度(特別是200 nm和240 nm)偏高;在MADLS卻觀察到相反的趨勢:MADLS更傾向于“低估”大顆粒的顆粒濃度。

1.2 混合樣品檢測比較

將已知平均粒度為60 nm、100 nm和150 nm的粒子按1:1:1混合后用不同的技術進行檢測。根據峰的分布,可見各種技術都可以分析出多個峰。但是除了TRPS和nFCM可以分析出3個峰,其余技術的多峰分析結果都不是很理想。


分析濃度時發現:NTA,TRPS,nFCM和AF4-MALS檢測待測樣品混合物中各個種群相關的平均粒徑與標準樣品高度相近,CLS則不然。與1.1 單一樣品檢測中出現的情況一樣,CLS測量的尺寸始終小于理論值(偏差約為11%),這可能是由于其是通過粒子布朗運動推算出結果而不是測量其真實值的測量方式導致的誤差。


從表9數據上來看,六種不同技術測量相同聚苯乙烯標準樣品濃度值高度一致。唯一的邊緣異常值是NTA,它“高估”了標準顆粒的濃度。NTA對濃度的這種“高估”情況與Bachurski和 Vestad等人最近報道的結果一致。其中Nanosight NS300和NS500對聚苯乙烯和二氧化硅納米顆粒標準品(100-150 nm)的濃度分別高估了約100%和130%-160%。這種高估的可能原因與測量參數的選擇(相機設置和檢測器閾值)有關。

二 脂質體樣本檢測比較

對于基于光散射的測量技術,脂質體常作為制作樣本標準顆粒的主要成分(Simonsen, 2016;Valkonen等,2017),因其表面的理化性質(如折射率,表面結構等)相比聚苯乙烯更接近生物樣本的膜結構。實驗選擇了一種商業上可買到的、具有良好特征的單分散的聚乙二醇化脂質體樣品(包含三種不同的脂類:膽固醇、HSPC和MPEG-DSPE)作為檢測對象,平均理論尺寸為78 nm。


結果顯示:所有檢測方式得出的脂質體平均濃度(1.87 * 1014 / ml)與理論值高度相似,平均濃度是使用NTA,TRPS和AF4-MALS進行濃度測量得出的平均值(參見表10)。其中NTA,TRPS和AF4-MALS測得的濃度基本一致(CV = 27%),但nFCM的濃度明顯低于所有其他方法(比其他方法低11倍)。其中nFCM的測量值最低,而NTA的測量值最高。

就測量直徑而言,NTA,TRPS和AF4-MALS測得的數據均在標準品脂質體尺寸的10%nm的誤差范圍以內,而nFCM 的尺寸分布則明顯偏斜向較小的直徑,眾數直徑為53 nm。對于nFCM朝著較小直徑的這種偏移可能是由于使用了二氧化硅納米顆粒尺寸作為標準品定量,該標準品的折射率比脂質體固體顆粒的折射率更高。

其中需要注意的是,AF4-MALS 粒度分布結果對折射率變化非常敏感。對他來說確定不均勻的生物納米粒子的折射率并不是一件容易的事,因此由于折射率不確定,濃度測量結果可能具有很高的不確定性。例如,當按目前的方法估計脂質體的折射率為1.45而不是1.392(Matsuzaki等,2000)時,測得的脂質體濃度將從1.3 * 1014 ml明顯降低至1.6 * 1013 / ml。因此AF4-MALS 技術并不適合測量脂質體的粒度分布。

脂質體樣品也無法通過CLS進行測量,原因是尺寸過較小,并且顆粒之間的密度差異和測量中使用的蔗糖梯度之間的差異很?。〝祿达@示)。

三 EVs樣本檢測比較

囊泡EVs是在納米醫學領域的較大的一個分支,鑒定EVs的濃度和粒徑分布對下游的實驗具有十分重要的意義。為還原檢測EVs環境的真實性,新鮮的EVs樣本取自COAG-NORM凍干血漿(Diagnostica Stago S.A.S.)使用IZON qEVoriginal / 70 nm尺寸排阻色譜柱(尺寸排阻色譜法,SEC)進行EVs分離。該色譜柱的樹脂孔徑約為70 nm,最佳分離尺寸為70-1000 nm,0.5 mL血漿樣本通常15分鐘的時間即可將EVs和血漿蛋白分離開,從而得到高度純化的囊泡。隨后總共收集了500 μl樣品,并將其平均分配給所有儀器進行測量。


表11 是對NTA,TRPS,nFCM,CLS和AF4-MALS檢測血漿EVs樣品的數據。用不同技術測量的EVs濃度之間存在很大差異。為了使結果在各種技術中具有可比性,分別在80-250 nm和50-400 nm兩個尺寸范圍內分別評估了濃度。nFCM,NTA和TRPS濃度的結果處于相同的數量級,但CLS結果卻高出兩個數量級,其中NTA測得的EVs濃度最高,而nFCM測得的最低。NTA和TRPS三個重復實驗中取平均值,CV分別為19%和1%。

實驗缺少使用MADLS和AF4-MALS對EVs的測量數據,因為MADLS無法解析EVs大小范圍內的多分散樣品的粒度分布,雖然是按照Zhang&Lyden文中所描述的AF4-MALS方法對EV進行測量,但也許因為本實驗所用樣本濃度過低導致回收率始終達不到70%。

小結

本研究通過對聚苯乙烯標準樣品(粒度范圍:50-300 nm)的檢測顯示,上述六種方法都可以計算出粒度的分布,并且這幾種不同方法測得的結果都有很高的相似性(相似度在90%之內)。但是,在某些情況下,有一些粒度檢測方法需要應用復雜的數理統計計算顆粒濃度,例如CLS的手動基線減法,或使用為AF4-MALS開發的新型粒度分布計算算法。但當樣本變得復雜,某些方式提供的結果就開始變得不太準確,例如CLS和AF4-MALS在其濃度測量范圍內無法檢測到較小的種群??偠灾?strong style="font-weight: 600;">就復雜混合物的分辨力而言,nFCM,TRPS,CLS和AF4-MALS的性能較優越,而MADLS無法解決多峰混合物,而NTA需要通過檢測后的一些處理方式來估算在混合樣本中重疊的各種種群的百分比分布。

用上述方法鑒定脂質體標準樣本的結果顯示,NTA,TRPS和AF4-MALS測得的濃度和粒徑分布非常一致(方差系數為27%),而nFCM測得的濃度明顯低于所有其他方法(比其他方法低11倍)。其中NTA,TRPS和AF-MALS測得的平均濃度與理論值非常接近(誤差15%以內)。

復雜生物樣本細胞外囊泡EVs的測量一直是最具挑戰性的。對于NTA,TRPS和nFCM而言,測得的濃度和尺寸分布(尺寸范圍在80-250 nm之間當樣本)都在一個數量級之內,這表明NTA,TRPS和nFCM等單顆粒分析技術非常適合于測量諸如EVs等生物樣品;CLS與單上述顆粒分析技術相比,測得的濃度明顯偏高;對于AF4-MALS,其測得的濃度低于可接受閾值,在測量生物樣本上該技術需要進一步地改進。

展望

對于EVs等復雜樣本,使用多種方法反復驗證納米顆粒的粒徑和濃度分布結果可以幫助實驗人員對未知樣本有更好的認識。

其中公認的一個結論是,NTA測量EVs的數值偏大,納米流式的結果偏小,TRPS的結果在以上幾種方法中最接近于真實值。考慮到可能的原因是基于光學原理的測量方法對于囊泡類生物樣本的測量會受其表面的結構差異產生與實驗無關的光學測量偏差。

因此對于EVs等樣本,采用非基于光學的測量方式(如TRPS)無疑是最合適選擇。



文中所提到的IZON尺寸排阻色譜柱

TRPS技術可聯系

李經理(152 0636 2775)

相關文獻

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本文轉自公眾號“廣州云星”