文獻賞析

如何選擇好用的外泌體提取試劑盒?

2021/04/02

外泌體作為直徑在30-150 nm的細胞外囊泡,廣泛存在于血液、唾液、尿液等多種體液中。在生理和病理條件下,幾乎所有類型的細胞都可以釋放外泌體,這些外泌體通過運輸關鍵核酸、蛋白質和脂質等進行細胞通訊和表觀遺傳調控,影響多種疾病的發生發展1。因此,對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析,同時也將用于疾病的治療。目前,限制外泌體基礎研究和應用研究的技術障礙主要包括如下兩個方面:1)首先,如何簡化提取步驟和提高外泌體的產量;2)如何有效區分外泌體與其他細胞外囊泡,特別是功能性微囊泡。

在過去的幾十年中,盡管仍然沒有標準化的外泌體分離方法,但是通過外泌體的理化特征已經建立了多種技術2,包括1)PEG(聚乙二醇);2)FC(超濾);3)SEC(尺寸排阻);4)dUC(差速離心);5)DG(密度梯度離心);6)AF4(切向流過濾);7)IP(免疫親和)。其中dUC(差速離心法)是研究報道中更常見的分離策略,但是差速離心法也存在一些不足的地方,如:1)所需樣本量大;2)外泌體得率低;3)需要昂貴的儀器設備——超速離心機;4)耗時長——全過程約需要4-9 h。為了解決以上問題,市場上出現了種類越來越多的外泌體提取試劑盒,它們依據外泌體的理化特征(大小、密度、表面maker等)實現外泌體的分離,且在基礎科研中的應用越來越廣泛。試劑盒在一定程度解決了UC提取的所需樣本量大、得率低、設備難、耗時長的問題,但試劑盒的適用范圍、質量好壞等參差不齊,針對特定的樣本和特定的實驗目的,以及自身的實驗條件,選擇更為合適的外泌體提取試劑盒對下游工作的開展至關重要。

近來上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院的科研人員開展了一項研究(PMID: 32716349),系統的比較多種商業化試劑盒與UC法提取血漿外泌體的差異,為科研工作者采用商業化試劑盒提取外泌體提供了一定的參考3。研究人員入組了9例癌癥患者(其中正常對照、早期患者、轉移患者各3例),將同組患者的血漿合并,總共得到3份血漿樣本,每組的血漿樣本分為6等分,分別采用5種商業試劑盒包括Wayen Exosome Isolation kit(WY,華盈生物)、ExoQuick(SBI)、miRCURY Exosome Kits(Qiagen)、Ribo Exosome Isolation Reagent(Ribo)、Total Exosome Isolation (Fisher)和UC(ultracentrifugation)分離外泌體。最后,對分離得到的外泌體進行轉錄組測序,比較各種分離方法在測序結果上的差異(圖1)。

圖1.各種外泌體提取試劑盒和超速離心方法的操作流程


首先,各種試劑盒在提取的外泌體粒徑上并無明顯差異,檢測的外泌體粒徑均在100 nm左右(圖2A)。但相對其他試劑盒,Wayen Exosome Isolation kit在外泌體提取濃度上相對較高,1mL血漿樣本含有更多的外泌體顆粒,而UC提取的外泌體濃度在所有方法中相對較低(圖2B)。

圖2. 各種方法分離的外泌體粒徑和濃度的比較


隨后,研究人員對提取的外泌體進行了RNA的建庫,Wayen Exosome Isolation kit提取的外泌體RNA在200-1000bp片段范圍內均得到更高的豐度(圖3)。

圖3.各種方法分離的外泌體evRNA文庫長度分布的比較


接著,研究人員對比分析了各種試劑盒提取的血漿外泌體中各種類型RNA的比例,發現Wayen Exosome Isolation kit的表現和UC更為接近,所測得的short-noncoding RNA, pseudogene, long-noncoding RNA 及protein-coding genes比例基本相同,而其他試劑盒檢測結果與UC存在較大差異(圖4)。

圖4. 不同方法分離的外泌體中各類RNA的比例


最后,關于各種方法提取的外泌體進行RNA的聚類分析,無論是Control組、primary組,還是metastatic組,同樣是Wayen Exosome Isolation kit提取的外泌體RNA與UC組更為接近(圖5)。

圖5. 不同方法分離的外泌體中RNA聚類分析


總體來說,Wayen Exosome Isolation kit提取的血漿外泌體在用于轉錄組分析上,其表現與UC更為接近。

結合上述實驗結果,以及UC和Wayen Exosome Isolation kit的分離特點,我們提出如下建議:

1) 當我們樣本量較少的時候,UC得到的外泌體量較少,可以考慮采用Wayen Exosome Isolation kit方法;

2) 當我們樣本量足夠,想要得到更多外泌體或者濃縮外泌體用于下游實驗的時候,可以考慮采用Wayen Exosome Isolation kit方法;

3) 當我們通過UC或者密度梯度離心獲得的高純度外泌體完成核酸或者蛋白組篩選后,進一步需要對個別分子進行驗證實驗的時候,采用Wayen Exosome Isolation kit方法提取外泌體更方便,也更容易標準化。

4) 針對外泌體核酸測序等實驗,采用Wayen Exosome Isolation kit方法不僅能夠接近UC的外泌體得率問題,而且能夠獲得與UC更為接近的核酸譜。

Wayen Exosome Isolation kit為華盈生物自主研發的Exosome Isolation Q3(簡稱EIQ3)系列外泌體提取劑盒,不僅有效提高外泌體得率,同時能夠顯著減少雜蛋白殘留(如血清高豐度蛋白)。該試劑盒可以實現血清、血漿、尿液、細胞上清等液質樣本中外泌體的快速提取,為后期外泌體研究的數據穩定性和可靠性提供保障。其主要特點在于:1)外泌體純度高(Quality);2)外泌體得率高(Quantity);3)操作簡便,周期短(Quick)(操作流程見圖6)。

圖6 EIQ3外泌體試劑盒使用方法


相關文獻

[1] Raghu Kalluri, Valerie S., The biology, function, and biomedical applications of exosomes. [J]. Science. 2020 Feb 7;367(6478): eaau6977.

[2] Cocozza F, Grisard E, Martin-J Aular L, Mathieu M & C Théry., Snapshot: extracellular vesicles. [J]. Cell. 2020;182(1), 262-262.e1.

[3] Peng C, J Wang, Bao Q et al., Isolation of extracellular vesicle with different precipitation-based methods exerts a tremendous impact on the biomarker analysis for clinical plasma samples. [J]. Cancer biomarkers : section A of Disease markers. 2020;29(3):373-385.

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