文獻賞析

小樣本量的血漿來源外泌體如何開展機制研究?

2021/05/25

隨著外泌體研究熱度的逐漸升溫,很多臨床醫生都希望在自己的業務領域中也能夠利用外泌體做一些基礎研究。然而,受到臨床樣本資源和經費的限制,往往美好的想法到具體落實的時候總覺得心有余而力不足。對于臨床醫生來講,最容易獲得的臨床樣本就是各種各樣的體液,包括:血漿、腹水、胸水、尿液、唾液等,外泌體又幾乎存在于所有體液中。體液中的外泌體包含的載運蛋白、核酸等功能性分子又可靶向特定的組織,參與細胞間通訊,組織微環境的重構等生理和病理過程。外泌體的這些獨特的特點正好解決了臨床醫生在基礎科研路上的關鍵難題。那么,如何利用相對而言易于獲取的體液樣本開展比較深入的機制研究呢?尤其在樣本數量不多,經費受限的情況下開展此類研究,成為很多粉絲經常問到華盈視角小編的問題。

今天,華盈視角將通過一個精彩的案例的分享,幫粉絲們揭開利用血漿收集的外泌體開展疾病機制研究的具體思路。希望通過我們的分享,能夠幫助更多的臨床醫生朋友順利開展外泌體相關的機制研究,掃除科研路上的攔路虎。



  



血漿外泌體保護心肌缺血再灌注損傷

此案例是發表于心血管領域的頂刊J Am Coll Cardiol雜志 (IF=20.589)的一篇代表性文章。具體的研究內容如下:

動物實驗證明血漿外泌體的心肌保護作用

1. 再灌注損傷的大鼠模型尾端靜脈注射正常鼠血漿外泌體(Control exosomes)、遠端缺血預處理(RIC)的大鼠血漿外泌體(RIC exosomes),發現不管是正常鼠還是RIC大鼠的血漿外泌體都能減少心肌再灌注損傷的程度(圖1A);
(RIC可以讓心臟處于受保護的狀態,免受再灌注損傷)


2. 大鼠心肌細胞缺氧復氧模型模擬缺血再灌注損傷,然后再用大鼠血漿外泌體處理損傷的細胞,可以顯著降低細胞死亡,作用效果和外泌體濃度呈現依賴性(圖1B)。該動物實驗說明血漿外泌體可以保護再灌注對心肌的損傷。                                             23e017cba9b9e495b7a43ee59803b93.png


圖1.血漿外泌體保護心肌免受再灌注損傷

收集臨床血漿外泌體

1. 收集來自6個健康人的總共60ml血液,分離的血漿用來提取血漿外泌體(Control exosomes);
2. 6個健康人經過RIC后,再次收集血漿外泌體(RIC exosomes);
3. NTA分析發現RIC可以顯著增加血漿中外泌體的濃度,但粒徑大小不會改變(圖2)。


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圖2. RIC增加血漿外泌體的濃度

血漿外泌體保護心肌免受損傷的機制研究


1. 血漿外泌體激活參與心肌保護的幾個重要的相關激酶

(1) 大鼠和人的血漿外泌體處理大鼠心肌細胞,都可以激活p-ERK1/2,但是和胰島素處理相比,血漿外泌體不能激活p-AKT,說明血漿外泌體不會激活胰島素信號通路(圖3A)。

(2) 人的血漿外泌體處理損傷細胞模型,可以顯著降低細胞死亡,但是加入ERK1/2的抑制劑U0126和D98059后,血漿外泌體的作用消失,說明血漿外泌體對心肌細胞的作用依賴于心肌細胞中ERK1/2的活性(圖3B)。

(3)血漿外泌體還可以激活ERK1/2下游的另外一個心肌保護的重要蛋白HSP27(圖3C)。

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圖3. 血漿外泌體激活心肌細胞內的相關蛋白
2. 血漿外泌體怎樣激活心肌細胞內的相關蛋白?
(1) 前期的研究發現了HSP70是一個重要的心臟保護蛋白,HSP70是一個損傷相關的模式分子,可以結合TLR4受體發揮作用激活下游的分子。并且RIC可以顯著增加體內循環HSP70的濃度。為了證實HSP70存在與外泌體中,研究者通過流式技術發現了HSP70表達在人的血漿外泌體膜上,并且通過一個識別HSP70膜形式的抗體cmHsp70.1驗證了HSP70可以表達在血漿外泌體的膜上,而RIC可以顯著增加血漿外泌體中HSP70的表達。最后,通過免疫膠體金電鏡也證實了HSP70存在于血漿外泌體的膜上的事實(圖4)。

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圖4. RIC增加血漿外泌體膜上HSP70的表達


(2) 為了證實血漿外泌體通過膜上的HSP70激活心肌細胞內的相關蛋白,外泌體預先和cmHsp70.1抗體孵育,中和部分HSP70,之后再處理心肌細胞。結果發現,中和HSP70的外泌體對ERK1/2和HSP27的激活作用減弱,保護損傷細胞免受死亡的作用消失,說明了外泌體依靠膜上的HSP70發揮作用(圖5A,B)。    

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圖5. 血漿外泌體激活心肌細胞內的HSP70-TLR4-ERK1/2-p38MAPK-HSP27信號級聯

(3) 利用TLR4的抑制劑TAK-242處理細胞,發現血漿外泌體激活ERK1/2和HSP27的作用也減弱,說明外泌體執行功能依賴與HSP70和TLR4相互結合。HSP27上游重要的激酶是p38MAPK,利用p38MAPK的抑制劑SB203580處理細胞,發現血漿外泌體不再激活HSP27,但是可以激活ERK1/2,說明p38MAPK位于ERK1/2的下游,HSP27的上游(圖5C)。最后分別利用這些抑制劑和血漿外泌體同時處理損傷的細胞,發現血漿外泌體保護損傷細胞免受死亡的作用消失(圖5D)。綜上實驗,說明了血漿外泌體對心肌細胞保護作用通過促進HSP70-TLR4-ERK1/2-p38MAPK-HSP27這條信號通路的激活發揮的(圖6)。


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圖6.血漿外泌體保護心肌損傷的機制模擬圖


華盈視角

本文值得借鑒的設計亮點:
1. 將先前的相關研究成果通過外泌體整合在了一起
2. 通過分離血漿外泌體進行功能實驗
3. 將動物來源的血漿外泌體和臨床樣本來源的血漿外泌體聯合分析
4. 如何發現外泌體功能分子并進行結構定位
5. 如何將外泌體功能蛋白與經典細胞信號通路進行鏈接     

小結與拓展


這篇文章將臨床樣本來源的血漿外泌體與動物模型和細胞模型結合開展功能實驗,非常新穎,特別適合臨床上小樣本的外泌體研究。同時,華盈視角也總結了該類研究的幾個關鍵技術點供粉絲們參考:

1. 關于外泌體功能分子的篩選方案:此案例基于文獻調研和研究背景發現了外泌體的功能蛋白,其實這樣的篩選風險很大。推薦的技術路線應該是基于組學技術篩選差異分子,結合文獻和數據庫等進行驗證更為穩妥。但是,對于血漿提取外泌體來說,常規的超速離心獲得的外泌體純度并不高,會引入血漿游離高豐度蛋白等污染物,干擾以質譜為代表的外泌體蛋白質組的分析結果。華盈視角強烈推薦科研人員通過qEV(尺寸排阻法)提取血漿外泌體,這樣可以有效去除高豐度蛋白的污染(Wallis et al. J Extracell Vesicles. 2021;10:e12041.),提高外泌體蛋白質組的鑒定效率和準確性。


2. 因為前期研究發現了很多相關的下游功能分子,所以研究者分別驗證了外泌體對這些蛋白的調控作用,最終繪制了一條完整的信號通路。外泌體下游的深度研究是揭示外泌體作用的關鍵環節,但是我們不可能總是像這篇文章的思路一樣可以精準的查閱到下游的功能蛋白和信號分子,所以需要更合理和有效的技術去篩選和挖掘下游的分子和通路,那么怎樣去篩選這些分子和信號通路呢?我們推薦研究人員在信號通路確定階段可以利用廣譜磷酸化抗體芯片技術對外泌體處理后的受體細胞開展信號通路的篩選,這樣可一次性對多條信號通路進行同步篩選,省時、高效,對于發現外泌體作用后激活的細胞信號通路乃至信號網絡都能起到事半功倍的效果。
華盈生物目前已經形成了一套更完善、更專業、更具特色的外泌體科研服務體系,涵蓋外泌體的分離、鑒定、組學分析(蛋白質組/轉錄組/miRNA/lncRNA)、外泌體標記和示蹤、深度的下游機制分析(20K芯片篩互作蛋白、磷酸化抗體芯片篩信號通路)等。華盈生物以更專業的服務品質和更完善的服務體系助力大家更好的開展外泌體功能研究。


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華盈生物作為外泌體服務領域的專家,擁有獨特的系統性服務優勢,可實現外泌體研究的“一站式服務”。華盈生物的外泌體服務產品也基本擴展到了外泌體研究的方方面面(紅色為華盈生物特色服務),包括:外泌體的三項鑒定(電鏡、WB、NTA)、外泌體蛋白組篩選(label free、DIA、PRM、MRM)、外泌體核酸篩選(miRNA、RNA全轉錄組)、外泌體納米流式檢測、外泌體電轉(藥物分子、核酸)、外泌體細胞&動物功能實驗(PKH26/DiO/量子點、熒光示蹤)等。

參考文獻

 Vicencio JM, Yellon DM, Sivaraman V, Das D, Boi-Doku C, Arjun S et al. Plasma exosomes protect the myocardium from ischemia-reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 2015;65(15):1525-36. (IF=20.589)  

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