文獻賞析

Nature Commun:外泌體脂質與胰島素抵抗機制研究

2021/06/28

胞外小囊泡(sEVs)可以介導脂肪組織、肝臟、骨骼肌和免疫細胞之間的通訊聯系,促進主要效應器官對胰島素的耐受和敏感性,在肥胖及其代謝并發癥的發展中發揮作用[1]。華盈視角上一篇公眾號文章 “Cell Metabolism:外泌體miRNA與胰島素抵抗” 介紹了外泌體中的miRNA調控胰島素抵抗作用機制的研究思路。華盈視角今天分享的新文章主要聚焦在外泌體脂質與胰島素抵抗的機制研究策略上。

已有研究證明了生物活性脂質在非脂肪組織中的積累,也可以促進胰島素敏感性的損害,異常高的細胞磷脂酰膽堿(PC)脂質會影響能量代謝,并與胰島素抵抗有關[2]?;谇叭搜芯炕A,外泌體的脂質與胰島素抵抗等代謝疾病的發生及演化關系就存在一定的想象空間,值得深入研究。而具體的研究思路,我們可參考2021年Nature Communications雜志上發表的題為“High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance”文章[3]。該研究發現高脂飲食(HFD)會顯著改變腸道上皮外泌體的脂質譜,外泌體磷脂酰膽堿(PC)會與肝細胞中表達的芳烴受體(AhR,aryl hydrocarbon receptor)結合進而抑制胰島素激活途徑及其關鍵信號通路PI3K/Akt,造成胰島素抵抗。本研究具體思路如下:



第一步:外泌體分離鑒定


首先,作者收集了高脂飲食(HFD)的肥胖小鼠或II型糖尿病患者的糞便樣本(將糞便顆粒收集重懸于PBS 中并手動切碎),采用蔗糖密度梯度離心(圖1A)的方法提取外泌體,并通過電鏡(圖1B)、NTA(圖1C)、Western Blot(圖1D)對外泌體進行了鑒定。隨后,作者推測外泌體可能來源于腸道上皮細胞,所以通過Western Blot和免疫熒光檢測了分離的外泌體中表達腸道上皮細胞marker A33蛋白(圖1D)。

圖1 L-Exo和H-Exo的電鏡、粒徑和Western blot鑒定(L-Exo:瘦鼠來源的外泌體,H-Exo:肥胖鼠來源的外泌體)


第二步:體內實驗驗證外泌體功能

作者將高脂飲食(HFD)的肥胖小鼠或II型糖尿病患者的糞便樣本中分離的外泌體通過灌胃給藥瘦鼠后,發現瘦鼠產生了胰島素抵抗性。主要表現在以下幾個方面:

1)在注射葡萄糖和胰島素后,H-Exos組的血液中葡萄糖殘留量明顯偏高(圖2)。

圖2 葡萄糖耐受試驗(GTT) 和胰島素抵抗試驗(ITT)

2)鉗夾試驗期間的葡萄糖輸注率明顯偏低(圖3A),血糖水平明顯偏高(圖3B)。血漿胰島素水平無顯著改變(圖3C)。

圖3 鉗夾試驗(The clamp assay)


第三步:外泌體攝取實驗

為了探究外泌體在何種器官富集以及被何種細胞攝取進而發揮作用,作者收集轉染GFP的MC38細胞上清的外泌體(注:作者前面富集的外泌體為CD63+A33+的外泌體,認為糞便中的外泌體來自腸道上皮細胞)注射到小鼠結腸中,6小時后在小鼠肝臟中檢測到GFP熒光信號(圖4A)。說明結腸部位的外泌體通過循環到了肝臟處。體外實驗通過PKH26標記的外泌體與Kupffe細胞(肝臟巨噬細胞)共培養,發現外泌體被肝臟巨噬細胞細胞攝?。?B、C)。


圖4 Exos被肝臟巨噬細胞攝取


第四步:通過外泌體脂質組學確定功能分子

作者隨后對L-Exo(低脂飲食小鼠外泌體)和H-Exo(高脂飲食小鼠外泌體)(圖5A、B),進行了脂質組學分析,發現了磷脂酰膽堿(PC)在肥胖鼠來源的外泌體中顯著升高(圖5C)。

圖5 L-Exo和H-Exo脂質組學分析

對Healthy-Exo(健康人外泌體)和T2D-Exo(II型糖尿病患者的外泌體)(圖6A、B)進行了脂質組學分析,發現了磷脂酰膽堿(PC)在糖尿病患者來源的外泌體中顯著升高(圖6C)。

圖6 Healthy-Exo和T2D-Exo脂質組學分析

通過人工構建高PC含量和低PC含量的外泌體(H-ExoLipds PC-:將H-Exo中的PC去除; L-ExoLipds PC+:將L-Exo中加入PC),注射到小鼠結腸中,發現注射L-ExoLipds PC+的小鼠血液中葡萄糖殘留量較注射L-ExoLipds的小鼠明顯偏高,而H-ExoLipds PC-的小鼠葡萄糖殘留量與H-ExoLipds的小鼠相比顯著降低(圖7A),體外實驗發現PCLipds處理和H-ExoLipds發揮和相同的功能,葡萄糖攝取明顯降低(圖7B),且PC含量較高的外泌體L-ExoLipds PC+和H-ExoLipds更多的被肝臟巨噬細胞攝?。▓D7C)。


圖7 外泌體PC的功能驗證


第五步:確定外泌體功能分子的下游作用機制

1. 作者通過細胞因子抗體芯片廣泛篩選了與胰島素抵抗相關的細胞因子,結果發現H-Exo處理的小鼠血漿和巨噬細胞分泌的中TNF-α、IL-6含量顯著上升,造成胰島素抵抗(圖8A)。

2. 有大量文獻報道AHR調控胰島素信號通路,于是,作者為探究H-Exo與AHR的關系,通過基因芯片發現H-Exo處理的小鼠肝臟組織中AHR等基因表達明顯上調(圖8B)。


圖8 細胞因子芯片、基因芯片研究外泌體PC作用機制

3. 通過Western Blot驗證H-Exo處理的小鼠肝臟組織中AHR蛋白表達也明顯上調(圖9A)。進一步,通過SPR技術(表面等離子共振)驗證了外泌體來源的PC可直接結合并激活AhR(圖9B)。

4. 通過PCR芯片發現胰島素信號通路相關基因IRS-2及其下游基因PI3K和Akt的表達受到抑制(圖9C)。并且缺失AHR后,外泌體對這些胰島素信號通路基因的調控效果消失。說明外泌體通過激活AHR從而抑制下游的基因表達。

圖9 SPR技術、PCR芯片研究外泌體PC作用機制

綜上結果表明腸道H-Exo被巨噬細胞和肝細胞吸收,H-Exo的PC和受體細胞表面的AHR結合,激活AHR后可抑制下游胰島素相關的基因表達和通路激活,從而對胰島素抵抗產生調控作用。

小結與展望

上述案例解析為大家展示了經典的外泌體脂質參與疾病發生發展機制的研究思路和技術路線。文章圍繞外泌體展開研究:首先對高脂飲食和正常飲食的小鼠進行外泌體的分離鑒定,發現高脂飲食小鼠或II型糖尿病患者的外泌體可以使瘦鼠產生胰島素抵抗性。隨后,通過外泌體示蹤發現其被肝臟富集,并被肝細胞和巨噬細胞攝取。然后,利用脂質組學技術對正常飲食和高脂飲食的小鼠外泌體的脂質譜進行篩選。發現外泌體膜上的磷脂酰膽堿(PC)在高脂飲食小鼠分泌的外泌體中發生了顯著改變。最后,通過敲低/過表達實驗及各種芯片對外泌體如何調控受體細胞功能,造成胰島素抵抗的機制綜合論證。

針對外泌體脂質相關研究,華盈視角的粉絲也經常會提出一些實際工作中會遇到的高頻問題,華盈視角小編也給大家提供一些建議:

Q1.外泌體中有各種蛋白、核酸,我們為什么要進行外泌體脂質研究?

1. 外泌體脂質含量多,類型多,目前有1116種脂質在外泌體中被發現,見Exocarta數據庫,包括常見且含量較高的鞘磷脂(SM)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰絲氨酸(PI)、磷脂酸(PA)、神經酰胺(Cer)以及膽固醇[4]。

2. 外泌體脂質發揮重要的生物學功能,可參與免疫監視、腫瘤微環境的修飾或炎癥的調節等[5];

3. 外泌體脂質與外泌體蛋白、miRNA一樣在醫學上均可以被用作生物標志物[6]。然而,受制于技術手段的限制,對于脂質組的研究相較于核酸和蛋白仍然存在較大空白區。

Q2.針對外泌體脂質研究,采用何種外泌體提取方法更為合適?

外泌體提取常用的方法為超速離心法,對于脂質研究需要獲得更高純度的外泌體,建議采用密度梯度離心的方法,華盈生物可提供完備的密度梯度離心技術服務。

Q3.針對外泌體脂質研究,如何確定目標脂質分子?

在提取外泌體以后,我們可以通過質譜進行脂質組學檢測,確定外泌體中脂質的含量及類別。華盈生物能夠提供超過500種脂質的絕對定量篩選服務,涉及20多種亞類,包括:鞘磷脂(SM)、磷脂類(PC、PE、PG、PI、PS)、神經酰胺(Cer)和甘油酯(TG、DG),部分檢測列表如下:

Q4.針對外泌體示蹤,目前有什么常用的方法?

在確定外泌體受體細胞的時候,我們經常會采用到體內和體外實驗進行外泌體示蹤。在體外細胞攝取實驗中,一般推薦常用的外泌體標記方法包括PKH26/DiO/花青素/量子點等,華盈生物可提供各種外泌體標記服務。

同時,我們特別推薦針對動物體內研究的外泌體標記示蹤技術——量子點標記。作為是一種低毒、高靈敏、非侵入性的實時活體成像的方法,量子點具有優良的近紅外(NIR)熒光,不僅具有較強的組織穿透性,而且可以極大程度避免體內示蹤實驗經常遇到的非特異熒光的干擾,是外泌體動物體內示蹤的首選技術。

Q5.本文涉及到的外泌體脂質研究的技術,華盈生物是否都能夠提供?

針對外泌體脂質下游機制研究,本文中用到的檢測技術包括:密度梯度離心、脂質組學篩選技術、細胞因子抗體芯片、基因芯片/測序、SPR表面等離子各種技術、PCR芯片/信號通路芯片、外泌體示蹤等,以上技術在華盈生物外泌體服務平臺均可找到“一站式服務”。


豐富全面的外泌體功能研究手段全都在華盈生物的武器庫中(紅色為華盈生物特色服務),歡迎電話垂詢:021-3393-8791。

相關文獻

[1] Wei Y, Hong G, Reis F, et al. MiR-690, an exosomal-derived miRNA from M2-polarized macrophages, improves insulin sensitivity in obese mice. [J]. Cell Metabolism. 2021 Jan 7; S1550-4131(20)30717-8.

[2] Van der Veen, J. N. et al. A role for phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in hepatic insulin signaling. [J]. The FASEB Journal, 2019. 33,5045–5057 (2019).

[3] Kumar A, Sundaram K, J Mu, et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. [J]. Nature Communications. 2021 Jan 11; 12(1):213.

[4] Record M, Silvente-Poirot S, Poirot M, et al. Extracellular vesicles: lipids as key components of their biogenesis and functions. [J]. Journal of Lipid Research, 2018 Aug 59(8):1316-1324.

[5] Record, Michel. Introduction to the Thematic Review Series on Extracellular Vesicles: a focus on the role of lipids. [J]. Journal of Lipid Research, 2018, 59(8): 1313–1315.

[6] Skotland T, Ekroos K, Kauhanen D, et al. Molecular lipid species in urinary exosomes as potential prostate cancer biomarkers. [J]. European Journal of Cancer, 2017, 70:122-132.

相關閱讀

Cell Metabolism:外泌體miRNA與胰島素抵抗

2021.06.02

圖片

公開信:關于近期Cell雜志發表的外泌體蛋白組文章待探討的幾個問題

2020.08.26

圖片

外泌體全轉錄組——發現新型疾病標志物的搖籃

2020.08.12

圖片

外泌體蛋白組如何幫助小樣本量標志物研究發到高分雜志?

2020.08.05

圖片

華盈視角:外泌體蛋白質組分析如何助力腫瘤微環境研究

2020.07.16

圖片

外泌體高分文章盤點,get一線研究熱點

2021.01.26

圖片

《JEV》外泌體粒徑分析選擇哪種檢測技術靠譜?

2021.03.18

圖片

如何選擇一個好用的外泌體提取試劑盒?

2021.04.01

圖片

小樣本量的血漿來源外泌體如何開展機制研究?

2021.04.14

圖片