蛋白質譜技術解答(FAQ)

華盈視角:蛋白質譜檢測技術解答(FAQ)

2020/08/03

1. 質譜儀器有哪些型號和種類?各項目類型有專門的儀器嗎?

目前有:Q-TOF、Orbitrap Elite、QE、QE plus、QE HFx、Fusion Lumos,從Q-TOF至Lumos精度和分辨率依次增加,蛋白組鑒定結果也遞增。

儀器不固定,需要考慮各平臺機時問題。如果項目周期較嚴格,我們不能保證儀器種類。

華盈生物的定量蛋白組服務會優先采用QE plus及更高靈敏度的儀器。

2. label free、iTRAQ/TMT、膠條鑒定項目的時間周期分別是多少呢?

label free     3-5周;

iTRAQ/TMT   5-7周;

膠條鑒定     2-3周;

磷酸化蛋白組  5-7周。

3. 蛋白鑒定的修飾分析只提供3種特定的分析嗎?是否可以鑒定磷酸化、乙?;绕渌揎??結果中是否可以看到哪一個氨基酸發生了修飾?

1)3種常規修飾:氧化,烷基化,乙?;?。

2)一般磷酸化、泛素化前期需要做富集,自然狀態下的磷酸化、乙?;牧糠浅I?,串聯質譜根據母離子的豐度選取 topN 進行二級碎裂來檢測,若前期不進行富集,最終鑒定到的磷酸化、乙?;亩慰赡懿欢?。若客戶不做富集,只在搜庫時加搜修飾,則最多接受6種修飾,且涉及收費,500元/例。磷酸化富集方法有TiO2富集、PTMscan等,

目前華盈可接磷酸化蛋白組的相對定量蛋白組質譜分析。

3)多肽信息表中(peptide)包含具體哪一個氨基酸位點發生了修飾。

4. iTRAQ/TMT標記定量質譜實驗中, 分10個組分(fraction)和20個組分(fraction)上樣檢出結果有多大區別?上機1h和2h大約有多大差別?

理論上來講,分的fraction越多,打到的蛋白種類會越多,打的時間越長,也會越多,但不是直接的線性關系。因為質譜檢測過程中,會在一級選取topN離子進行二級碎裂檢測,一個fraction對應一次上樣,分的fraction越多,時間越長,選取的top N次數會越多,所以被分析的蛋白會越多。

5. 多批次標記定量質譜如何設計實驗?客戶樣本為abcd四組,每組三例,共計12例樣本,怎么設計實驗?
做兩套iTRAQ,每套安排6例樣本+1例pool樣,7標。盡量安排2套中有所有組的樣本,比如:a1+b1+c1+d1+a3+b3+pool,a2+b2+c2+d2+c3+d3+pool。多批次中的pool樣建議是多個樣本的混樣,且各批次pool樣一致,理論上pool樣鑒定蛋白種類應該最多,用于批次間數據校正。

6. iTRAQ/TMT預實驗指的是什么,預實驗和正式實驗的關系?

預實驗包括:所有樣本的蛋白濃度測定,以及SDS-PAGE跑膠、取少數樣本進行酶解質控,酶解效率是否達到質控標準,預實驗包含于正式實驗中,正式實驗是包括預實驗到標記以及后續上機鑒定的所有實驗。

7. 蛋白制樣的過程當中是否加磷酸酶和蛋白酶抑制劑 cocktail?

需要加,加蛋白酶抑制劑防止蛋白被降解,加磷酸酶抑制劑防止磷酸化的丟失。

8. CoIP/IP/Pulldown產物跑膠的時候用銀染還是考染?

兩種都可以。一般產物比較少,銀染靈敏度較高,推薦銀染??既眷`敏度低,未出現條帶處也可能鑒定到蛋白。

9. 客戶需要質譜圖,是否可以提供?

兩種方案供客戶選擇:1)提供原始數據,可以自己拿回去用專業軟件讀取查找。2)3張以內的可以找,超過部分100元一張。

10.  Label free如何校正樣本?用內參嗎?

不設置內參。Labelfree數據采用Maxquant軟件搜庫,在搜庫時,軟件的MaxLFQ算法會對樣本進行校正,以消除處理、上樣、儀器等造成的樣本間誤差。參考文獻:[Cox Jürgen,Hein Marco Y,Luber Christian A et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.[J] .Mol. Cell Proteomics, 2014, 13: 2513-26.]