外泌體研究技術解答(FAQ)

華盈視角:外泌體研究常見問題解答(FAQ)

2020/08/03

1.華盈生物外泌體服務體系有哪些優勢?

華盈生物是中國國內做外泌體研究服務標桿性的企業,在外泌體服務領域,華盈生物具備幾個獨特的優勢:

1)公司技術部門高層是中國中國抗癌協會腫瘤標志專業委員會外泌體技術專家委員會的專家委員,是《外泌體研究、轉化和臨床應用專家共識》的制定者之一,與國際外泌體主流科學家團隊始終保持密切溝通。

2)華盈生物技術服務體系非常完整,包括:外泌體制備、外泌體鑒定、外泌體內容物篩選、外泌體標志物驗證等一套完整的技術流程,客戶可以獲得一站式服務體驗。

3)華盈生物技術平臺非常豐富(包括超離、尺寸排阻色譜、TRPS、NTA、質譜、抗體芯片、測序、基因芯片、數字PCR、Simoa等),在研究的每個技術環節,根據研究人員的現有條件和下游實驗需求,為其提供較為合適的技術選擇,以幫助研究人員更好的達到實驗目的。

4)華盈生物的技術團隊經驗豐富,研發能力強大,不僅完成了多物種(人、大鼠、小鼠、豬、細菌),多樣品類型(血清、血漿、卵泡液、精漿、唾液、尿液、腦脊液、房水、細胞上清:肝癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、膀胱癌細胞、單核細胞、肝巨噬細胞、成纖維細胞、脂肪干細胞、間充質干細胞)的外泌體研究服務,而且還自主開發了EIQ3外泌體提取試劑盒,市場口碑優秀。

5)華盈生物在外泌體業務上投入大,產品豐富,不僅有一站式服務體系,還提供尺寸排阻色譜柱(SEC)、EIQ3外泌體提取試劑盒、無外泌體血清、無血清培養基、外泌體marker特異抗體、外泌體染料、TRPS外泌體粒徑分析儀,外泌體自動收集儀等豐富的儀器設備,打造了一個外泌體研究的綜合平臺。

2. 外泌體研究中的細胞培養,能否先用正常培養液養到70%再換無外泌體血清的培養液? 

有些文章中確實會使用無血清培養液培養細胞然后收上清分離外泌體的方法,該方法是使用含有外泌體的血清培養細胞到一定密度,然后移除培養液,使用1×PBS清洗數次之后換無血清培養液進行培養即可。但是目前很多高分文章基本都是直接使用無外泌體血清的培養液進行細胞培養的。

 

3. 外泌體研究中的細胞培養,能否用無血清培養液培養?

推薦用含有無外泌體血清的培養液培養細胞,如果條件有限,可以考慮先將細胞使用有外泌體血清培養,細胞長到一個合適的密度如70%-80%左右時,移除培養液,37℃預熱的PBS清洗細胞3-5遍,換無血清的培養液,收集培養上清,分離外泌體。

4.哪種外泌體的分離純化方法比較好?

選擇分離純化的方法主要依據下游實驗綜合考量。如果是血清或血漿樣品,如果下游研究涉及蛋白組學實驗,對外泌體中高豐度脂蛋白的去除非常必要,推薦使用尺寸排阻色譜法(SEC)。對于核酸實驗,則可選方法較多,但要考慮樣品量與外泌體的得率之間的關系,核酸實驗普遍要求的外泌體量較蛋白組學實驗大,如果即樣品量充足,可以選擇超速離心或者SEC方法。如果樣品量少于1ml,建議選用聚合物沉淀法。每種方法均有優缺點,現舉例比較一下:

1)超速離心法:方法經典,需要特殊儀器設備,操作繁瑣,技術難度高,操作重復性差,耗時長,外泌體純度較高,但脂蛋白去除效果差;

2)聚合物沉淀法:操作簡便,技術難度低,耗時短,外泌體純度低,得率高;

3)尺寸排阻色譜法(SEC):高豐度蛋白HDL、LDL去除效果好,外泌體純度高,得率相對低,重復性好,易標準化操作;

 

5.外泌體標志物鑒定用哪個marker做WB好?

根據外泌體相關文獻的統計,排在前4位的檢測指標為CD63、TSG101、 CD9和CD81并列第三位;接著檢測較多的4個指標為Alix、 HSP70、 flotillin和Syntenin;此外還有一些指標僅少數文獻中出現過,例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT等。

針對外泌體的定性檢測建議選擇3個陽性指標CD9  CD81  CD63,以及1個陰性指標calnexin。

6.外泌體蛋白做WB用什么內參基因?

目前大部分文獻中沒有檢測內參基因,個別文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作為內參進行檢測,從文獻調研結果來看,外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達豐度相對于正常細胞樣品中的較低,Western blot檢測時可能會檢測不到任何條帶或者條帶微弱。因此,更多的是用等蛋白定量校準樣品間的差異。

7.外泌體研究時,一般用血漿還是血清?

外泌體研究最好使用血漿樣本進行實驗。血清是在血液凝固之后收集的液體,其中少了纖維蛋白原,凝血因子,以及多了很多凝血產物。有研究發現,在凝血過程中血小板會分泌大量外泌體,而血清中有接近50%的外泌體來源于這些額外的分泌;同時,血清凝固時會形成纖維網,將本來血液中的外泌體包裹在凝血塊中。這一正一反,就導致血清中的外泌體與常規疾病之間的關聯性低于血漿。另外,血漿=血液-血細胞 ;血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子。所以在特殊情況下,如果研究與血小板相關的疾病的時候,血清反而更適合。

8.外泌體Western blot鑒定時通常使用哪些公司的抗體?

文獻報道較多的兩個公司Abcam和Santa Cruz (sc-5275),目前SBI公司的抗體也比較多。目前文獻報道的其他公司還有ImmunoWay、Systems Biosciences Inc、Abnova、BD Pharmingen 、Thermo Pierce、Sigma-Aldrich、Systems Biosciences Inc等。

9.外泌體常見的研究方向

外泌體的研究主要包括三個方向:

1)疾病機理/耐藥研究:主要研究外泌體作為細胞間的擺渡車,介導細胞間通訊和在免疫方面起作用,屬于微環境研究的范疇。

2)標志物研究:主要研究外泌體種類、數目、大小和內含物與疾病之間的關系,對外泌體中的蛋白、核酸進行定量,以作為疾病的biomarker,其可預測疾病的發生與進展。

3)藥物研究:在靶向藥物的研究中,外泌體可作為載體可將包裹在其內的藥物運送到目標區域。

10.分離細胞培養上清中的外泌體需要多少體積上清?

細胞培養上清使用量取決于細胞系類型和細胞的狀態。一般來說干細胞分泌外泌體能力普遍較強,如間充質干細胞(MSC)。用超離分離外泌體,第一次摸索條件,起始細胞上清體積最好50ml以上,試劑盒法起始量最好10ml以上。根據摸索實驗結果結合下游實驗外泌體用量采用相應的上清體積。

 

11.分離血清&血漿中的外泌體研究需要多少樣本體積?

根據下游實驗外泌體用量,選用不同的樣本體積和方法。一般情況由于血清血漿樣本中外泌體的含量相對較高,完成一次蛋白組學實驗,試劑盒法所需樣本起始體積建議>200ul。排阻色譜柱法所需樣本起始體積建議>500ul,而超速離心法所需樣本起始體積建議>2ml之間。其他實驗需進行預實驗探索,與下游檢測技術也有關系,一般基因芯片的樣本用量要少于測序。

12.為什么超離后看不到外泌體沉淀?

這種問題通常有三種可能性,其一:樣本體積少,外泌體量少,得率低,從而造成了這樣的結果。其二:使用了不透明的超速離心管,一般來說外泌體產量都比較小,所以凡是不透明的管子,基本都是很難見到明顯沉淀。其三:部分品牌離心機的角轉管壁粘附性很低,超離結束沒多久沉淀就會滑落下去,所以在離心結束時需要盡快收樣。


13.外泌體電鏡是不是一定要有膜結構,無膜結構的球體對不對?

答:  負染電鏡結果中外泌體的形態理想狀態下應該呈現明顯的茶托狀!邊緣有一圈略微更明亮的亮圈。無膜結構的圓球形,很可能是脂蛋白顆粒(LDL)或者抱團的蛋白質。


14.待提取外泌體的細胞培養液如何保存,外泌體樣品又如何保存?

根據一些方法學相關文獻的報道。細胞培養液最好收集好后盡快分離其中的外泌體。兩三天的話只需要放在4°即可,不建議長時間保存培養液。外泌體樣品最好分離純化后直接使用,不要進行凍融,短時間兩三天放4°可以。如果需要保存時間超過7天以上,最好保存在-80°內。


15. 為什么會選擇CD63、CD9、CD81 以及TSG101、HSP70、ALIX等作為外泌體或者外泌體的標志物。

這些蛋白標志物其實最初是通過純化外泌體然后通過質譜分析發現的存在于外泌體的一些高豐度蛋白,因此也就開始逐漸將他們作為外泌體標志物。CD63、CD9、CD81三個蛋白都是四次跨膜蛋白家族的成員,直接參與了外泌體內容物的分選,TSG101是ESCRT復合體相關的蛋白,ALIX直接涉及到了囊泡在形成過程中切割脫離質膜形成獨立膜結構的過程。

16.外泌體標志性蛋白是外泌體上獨有的么?

不是。這些標志物蛋白其實主要是涉及到了囊泡的形成和分泌過程,多數是膜蛋白或者是ESCRT復合體成員及其相關蛋白,他們產生于細胞中,定位于胞內的膜結構附近,因此細胞中自然也會存在。只是因為外泌體的形成依賴于這些分子,因此這些分子在囊泡中發揮功能,因此在囊泡中豐度要明顯比細胞中更高一些。


17.為什么外泌體鑒定要做NTA測粒徑分布、電鏡看形態、WB檢測標志蛋白三個實驗?

答:  目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品,而且沒有任何一個單一實驗可以確定外泌體的存在。

比如超速離心和凝膠排阻層析都不能很好地去除血清中脂蛋白顆粒,即使使用梯度密度離心也是一樣。所以需要三項鑒定來確定純化的產物為外泌體。

再來看三種方法,電鏡可以看到形態,但是包括支原體、鐵蛋白聚團、溶酶體等它們形態很類似; NTA是一種測算粒子群體直徑分布和數量的計算方法,而觀測靠的是粒子對光路的影響,這一方法不能反映粒子形態,無論樣品是外泌體還是納米微珠,它都會算作粒子,因此也不能區分外泌體;WB是鑒定的是外泌體的一些標志物蛋白,但是目前的這些標志物蛋白只是會在外泌體里富集,而并不是外泌體所特有的,諸如CD63、ALIX等在細胞中都有,在一些細胞碎片、溶酶體、胞內體中也大量存在。因此需要三種方法共同進行相互驗證。

18.外泌體樣品如何定量?

目前外泌體的定量方法主要有三種:

1)通過BCA等方法對分離得到的外泌體進行蛋白定量,用測得的蛋白量來反映外泌體的量。

2)通過納米粒子計數儀對外泌體的粒子數進行計算,使用粒子數目來反映外泌體的數量。

3)使用外泌體表面特定的某一個標志物的ELISA定量數據來反映外泌體的數量,比如使用CD63 CD81等。

對于定量方法的選擇,三者選一即可,論文前后保持一致即可。BCA定量容易有雜蛋白影響、納米粒子計數也存在一定的誤差、ELISA分析的外泌體蛋白通常在其他膜結構和游離系統中都會有。

19.外泌體的網站有哪些

1) EVpedia數據庫(http://www.evpedia.info/);外體蛋白質組、轉錄組和脂質體

2) ExoCarta數據庫(www.excarta.org/);外泌體蛋白質、RNA和脂質體

3) Vesiclepedia 數據庫(http://www.microvesicles.org/)囊泡蛋白質、RNA和脂質體

4) EMBL-EBI數據庫;http://www.ebi.ac.uk/GOA/exosome

5) ExoRBase數據庫(http://www.exorbase.org/)循環RNA(CircRNA)、長非編碼RNA(LncRNA)和信使RNA(mRNA)的儲存庫

6) 尿Exosome蛋白數據庫(https:/hpcwebapps.cit.nih.gov/ESBL/Database/Exosome/)

7) ExRNA圖譜數據庫(http://exrna-atlas.org/